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陈匡时课题组在基于CRISPR的单分子成像DNA技术领域取得新进展
日期: 2018-05-04  信息来源: 工学院

工学院生物医学工程系陈匡时课题组基于CRISPR基因编辑技术与分子信标(MB)研制出一种名为CRISPR/MB的新型单基因位点成像技术。该研究成果已发表于Nucleic Acids Research (《核酸研究》)(IF = 10.162),题目为“A CRISPR/Molecular Beacon Hybrid System for Live-Cell Genomic Imaging”。

CRISPR基因编辑技术是一种能够有效且稳定地将目的基因敲除的方法。该技术是由Cas9蛋白与single-guideRNA (sgRNA) 组成。Cas9是一种DNA内切酶,sgRNA则同时具有能和特定基因组序列互补的位点(spacer 序列)以及和Cas9结合的结构域。因此,Cas9在与sgRNA形成复合体后能通过spacer序列靶向特定基因位点并将其破坏,从而达到定点编辑基因组的目的。前人的研究发现,失去酶切活性的Cas9(nuclease-deactivated Cas9, dCas9)也能够通过结合sgRNA靶向特定基因组,由此开创了使用dCas9与sgRNA成像特定基因组的研究领域。

目前,基于CRISPR技术在活细胞中标记基因组的方法主要通过将荧光蛋白连接于dCas9或sgRNA上实现成像。但是荧光蛋白具有亮度低、易被光漂白以及不能被淬灭等缺点,在单分子成像单基因位点上能力有限。本研究所使用的分子信标(MB)则是一种基于化学荧光基团、具有可淬灭特性的寡核苷酸探针(图1),其两端分别连有一个化学荧光基团和一个淬灭基团,在不与目的RNA结合时MB通过自身形成茎环结构呈现出低荧光状态,而在与目的RNA互补后茎结构解离进入高荧光状态,MB因其独特的成像优势成为目前活细胞标记内源RNA的主要手段之一。通过改造sgRNA 的结构,陈匡时实验室巧妙地将MB与CRISPR技术结合起来,成功研制出带有MB靶序列(MTS)的sgRNA (SL2-sgRNA-MTS),并证实 dCas9和SL2-sgRNA-MTS能形成稳定的复合体,并与特定的单基因位点结合。MB进入细胞后能与复合体中的MTS 互补,使得该基因位点被荧光标记。荧光成像显示,被标记后的单基因位点在传统荧光显微镜下呈现单一亮点 (图2)。CRISPR/MB的研发与应用有望帮助研究者对目的基因组在细胞核的转运与定位,及其与疾病的发生发展的关系等科学问题进行更深入的阐述。

图1:CRISPR/MB的工作原理。CRISPR/MB由dCas9,MB以及一个带有MB靶序列(简称MTS,绿色)的sgRNA组成。dCas9-sgRNA复合体通过sgRNA的spacer序列(紫色)结合基因位点后,MB与MTS的互补使得该基因位点被荧光标记。

图2:通过CRISPR/MB在细胞中检测特定基因位点。A-B)CRISPR/MB对单一端粒的成像。C)CRISPR/MB相较于传统荧光蛋白标记手段具有更高的光稳定性。D)CRISPR/MB对端粒(telomere)以及着丝粒(centromere)的双色标记。

该工作的第一作者是吴小天,毛诗琦、杨艳涛等学生为工作的顺利完成作出重要贡献。通讯作者为陈匡时特聘研究员。此项工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京市自然科学基金以及青年千人启动经费的支持。

 

编辑:凌薇


   
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